Физики повышают чувствительность и скорость метода рамановской микроскопии
В журнале Optics Express исследователи описывают свою новую методику, основанную на микроскопии когерентного антистоксового комбинационного рассеяния (CARS). Микроскопия CARS создает изображения на основе колебательных сигнатур молекул, используя взаимодействие между ультракороткими лазерными импульсами и биологическими образцами. Новый подход обеспечивает доступ к трудно обнаруживаемой области колебательного спектра, известной как область отпечатков пальцев, которая охватывает диапазон от 400 до 1800 см-1. Хотя многие отдельные соединения могут быть идентифицированы по их колебательным отпечаткам пальцев в этой области, они имеют тенденцию производить слабые сигналы, которые трудно обнаружить.
Схема экспериментальной установки B-CARS. HWP: полуволновая пластина; PBS: поляризационный светоделитель; LP: фильтр длинного пропускания; SP: фильтр короткого пропускания. Спектры насоса (красный) и Стокса (радужный). Схема конвейера обработки данных: (i) нейронная сеть, (ii) удаление NRB и (iii) методы классификации для получения изображения с ложными цветами. Авторы и права: Федерико Вернуччио и др., Optics Express (2022). DOI: 10.1364/OE.463032
Исследователи разработали безметочный и неинвазивный метод рамановской спектроскопии, который позволяет получать микроскопические изображения биологических образцов и идентифицировать широкий спектр биомолекул с беспрецедентной скоростью и чувствительностью.
«Наша работа может привести к созданию неинвазивного, не содержащего этикеток и удобного в использовании устройства для клинического использования», — сказал руководитель исследовательской группы Дарио Полли из Миланского политехнического университета в Италии. «Этот инновационный микроскоп в сочетании с алгоритмами, основанными на глубоком обучении, может в конечном итоге упростить и ускорить диагностику рака, позволяя визуализировать химические составляющие тканей и клеток человека».
В журнале Optics Express исследователи описывают свою новую методику, основанную на микроскопии когерентного антистоксового комбинационного рассеяния (CARS). Микроскопия CARS создает изображения на основе колебательных сигнатур молекул, используя взаимодействие между ультракороткими лазерными импульсами и биологическими образцами.
Новый подход обеспечивает доступ к трудно обнаруживаемой области колебательного спектра, известной как область отпечатков пальцев, которая охватывает диапазон от 400 до 1800 см-1. Хотя многие отдельные соединения могут быть идентифицированы по их колебательным отпечаткам пальцев в этой области, они имеют тенденцию производить слабые сигналы, которые трудно обнаружить.
«Обычно используемые методы в биомедицинских науках часто требуют окрашивания, которое не только громоздко, но также может привести к структурным и химическим изменениям, которые могут привести к артефактам или ошибкам при визуализации и обработке данных», — сказал Полли. «Поскольку наша система может различать множество различных химических видов в биологических тканях без меток, она может быть полезна для визуализации живых клеток и анализа биопсий тканей».
Меньшая частота повторения, более быстрая визуализация
Эта новая работа является частью проекта CRIMSON, целью которого является разработка устройства визуализации «под ключ», использующего колебательную спектроскопию для быстрой классификации клеток и тканей. Цель проекта — трансформировать изучение клеточного происхождения болезней, чтобы сделать возможными новые подходы, которые могли бы продвинуть персонализированную терапию.
В качестве ключевого шага к этой цели исследователи разработали микроскоп CARS на основе коммерческого лазера, который генерирует ультракороткие импульсы длительностью около 270 фемтосекунд в ближнем инфракрасном диапазоне длин волн. Они разработали систему микроскопии для использования лазерных импульсов с частотой повторения 2 МГц, что намного ниже, чем 40 или 80 МГц, используемые в большинстве других систем CARS.
Эта более низкая частота повторения снижает фототермическое повреждение образца, поскольку создает задержку в 0,5 микросекунды между двумя последовательными импульсами. Он также производит более высокую энергию импульса и пиковую интенсивность в фокусе, что создает более сильный сигнал CARS и обеспечивает более высокую скорость сбора данных.
«Наиболее важным преимуществом более низкой частоты повторения является то, что она позволила нам генерировать широкополосные стоксовы импульсы со смещением в красную сторону, которые охватывают всю область колебаний отпечатка пальца, используя генерацию суперконтинуума белого света в объемном кристалле», — сказал Федерико Вернуччио, докторант в Политехническом университете Милана и первый автор исследования. «По сравнению с другими методами этот подход технически проще, компактнее и надежнее».
Использование области спектра со смещением в красную сторону по сравнению со стандартными настройками означает, что до появления фотоповреждений можно использовать лазеры с более высокой интенсивностью. Исследователи также разработали новые алгоритмы, сочетающие стандартные численные вычислительные подходы с искусственным интеллектом. Эти алгоритмы извлекают больше информации из полученных данных и превращают ее в изображения, которые позволяют легко различать различные химические соединения.
«Благодаря нашим усовершенствованиям система CARS позволяет получать высококачественные изображения с самой современной скоростью», — сказал Вернуччио. «Наша система имеет время задержки пикселя менее 1 миллисекунды без ущерба для целостности образца. Эта скорость ограничена частотой обновления спектрометра».
Чувствительность к высокой скорости
Чтобы протестировать свою систему, исследователи использовали эталонные образцы для сравнения спектров, полученных с помощью нового микроскопа, со спектрами, полученными с помощью современного, хотя и более медленного, метода колебательной спектроскопии. Два метода показали отличное совпадение, продемонстрировав, что новая система может предоставлять спектры на очень высоких скоростях с хорошим спектральным разрешением и химической специфичностью.
Затем исследователи определили предел обнаружения своей системы, получив спектры CARS набора растворов диметилсульфоксида с различными концентрациями. Система смогла измерить концентрацию химических веществ с беспрецедентной чувствительностью 14,1 ммоль/л, что примерно вдвое превышает чувствительность других систем CARS, работающих в области отпечатков пальцев.
Они также продемонстрировали способность системы различать и пространственно локализовать различные прозрачные пластиковые шарики микронного размера на основе их вибрационных характеристик и провели измерения биологических тканей, чтобы продемонстрировать, что этот метод работает с биологическими образцами, не вызывая повреждений.
«Наш микроскоп CARS позволяет получать изображения без меток с химической специфичностью на более высоких скоростях, что делает рамановскую визуализацию живых клеток более осуществимой», — сказал Полли. «Это может позволить использовать нашу систему для анализа взаимодействия раковых клеток с иммунными клетками или, например, для характеристики того, как химиотерапия влияет на клетки».
В настоящее время исследователи работают над улучшением своей системы, создавая еще более широкий диапазон длин волн стоксова импульса посредством генерации суперконтинуума белого света. Это улучшит как скорость визуализации, так и количество обнаруживаемых химических аналитов. Они также работают над коммерциализацией, разрабатывая удобное программное обеспечение, компактные оптические источники и проекты коммерческого прототипа и системы обнаружения.
