Синие лазерные лучи вращаются вокруг объекта 100 раз в секунду (схема слева). Световые волны, рассеянные на клеточных структурах (клетки), таким образом, генерируют 100 изображений сверхвысокого разрешения в секунду. В течение 10 мс вращения (0-360°) непрерывно деформируемые световые волны создают четкое изображение клетки исключительно из рассеянного лазерного света, как показано на фотографии ниже. Предоставлено: А. Г. Рорбах.

Когда с наступлением темноты города превращаются в красочный мир огней, часто можно только оценить их контуры, которые, в зависимости от перспективы, могут привлечь внимание к ключевым деталям или мелочам. При флуоресцентной микроскопии биологические клетки помечаются флуоресцентными красителями и возбуждаются, чтобы они люминесцировали в определенных областях с помощью оптических переключателей, как ночной город. Однако этот свет обычно слишком слаб для небольших, быстрых объектов или даже гаснет через некоторое время. Это известно как «флуоресцентное отбеливание».

Теперь новый подход, разработанный профессором доктором Александром Рорбахом и его командой в Лаборатории био- и нанофотоники Фрайбургского университета, нашел способ сделать мельчайшие объекты четко видимыми без флуоресценции. Таким образом, клеточные структуры или частицы размером с вирус можно наблюдать в 100–1000 раз дольше, в 10–100 раз быстрее и с почти удвоенным разрешением по сравнению с флуоресцентной микроскопией . В то время как флуоресцентная микроскопия записывает то, что вы могли бы назвать «ночными изображениями» структур, микроскопия ROCS позволяет получать «дневные изображения» — противоположности, которые могут превосходно дополнять друг друга. Рорбах и его коллеги описывают различные применения технологии в последнем выпуске журнала Nature Communications .

Синий лазер направленно освещает объект под косым углом

Используемая ими технология известна как «вращающееся когерентное рассеяние» (ROCS) и использует быстро вращающийся синий лазерный луч. «Мы используем несколько физических явлений , знакомых из повседневной жизни, — объясняет Рорбах. — Во-первых, небольшие объекты, такие как молекулы, вирусы или клеточные структуры, больше всего рассеивают — или распространяют — синий свет, который известен по молекулам воздуха в атмосфере и который мы воспринимаем как голубое небо». Маленькие объекты рассеивают и направляют в камеру примерно в десять раз больше частиц синего света, чем красных, и тем самым передают ценную информацию.

Во-вторых, ROCS направляет синий лазер под очень косым углом на биологические объекты, потому что это заметно увеличивает контраст и разрешение. Нам это тоже знакомо: если держать бокал под углом к ​​свету, гораздо легче заметить грязь или отпечатки пальцев. В-третьих, ученые освещают объект косым лазерным лучом последовательно со всех сторон, потому что освещение только с одного направления произвело бы много артефактов.

100 изображений живых клеток в секунду

Физик из Фрайбурга и инженеры из Департамента микросистемной инженерии (IMTEK) вращают косой лазерный луч вокруг объекта сто раз в секунду и тем самым производят 100 изображений в секунду. «Итак, за десять минут у нас уже есть 60 000 изображений живых клеток, которые оказались гораздо более динамичными, чем считалось ранее», — говорит Рорбах. Однако такой динамический анализ требует огромной вычислительной мощности для обработки всего одной минуты визуального материала. Поэтому сначала необходимо было разработать множество компьютерных алгоритмов и аналитических процессов, чтобы данные можно было правильно интерпретировать.

Вместе со своим коллегой доктором Феликсом Юнгером и в сотрудничестве с различными исследовательскими группами Фрайбурга Рорбах смог продемонстрировать возможности микроскопа, используя различные клеточные системы: «Нашей основной целью было не создание красивых картинок или фильмов с неожиданно высокой динамикой клеток — мы хотели получить новые биологические знания». Например, технология ROCS позволила им наблюдать, как тучные клетки открывают небольшие поры всего за несколько миллисекунд при стимуляции, чтобы выбрасывать сферические гранулы с необъяснимо высокой силой и скоростью. Гранулы содержат медиатор гистамин, который впоследствии может привести к аллергическим реакциям.

Наблюдение за поведением связывания частиц размером с вирус

В другой серии экспериментов исследователи смогли наблюдать, как крошечные частицы размером с вирус танцуют с невероятной скоростью вокруг шероховатой поверхности клеток-мусорщиков, предпринимая несколько попыток найти точку связывания на клетке. Эти наблюдения послужили предварительными тестами для текущих исследований связывающего поведения коронавирусов.

Кроме того, технология ROCS использовалась в рамках кластера совместных исследований CRC 1425, посвященного образованию рубцов при поражениях сердца. Фибробласты, то есть клетки рубцовой ткани, образуют тонкие трубки толщиной 100 нанометров, так называемые нанотрубки, которые в 1000 раз тоньше волоса. С помощью этой новой технологии Юнгер и Рорбах смогли обнаружить, что эти трубки вибрируют тепло в миллисекундном масштабе, но это движение со временем ослабевает. Согласно математическому анализу активности, это указывает на механическое затвердевание нанотрубок.

В других экспериментах ученые наконец-то смогли наблюдать на многих тысячах изображений, как филоподии — «пальцы» клеток-мусорщиков — ищут в окружающей среде добычу, используя сложное колеблющееся движение, и как филоподии могут изменять свой цитоскелет с неизвестной ранее скоростью.