Компактный и эффективный сканирующий микроскоп с фотонным разрешением
Разработан компактный и эффективный микроскоп ISM (сканирующая микроскопия изображений), оснащенный матричным детектором однофотонных лавинных диодов (SPAD), способным обеспечивать структурные и функциональные изображения с высоким разрешением в единой архитектуре. Исследование опубликовано в журнале Advanced Photonics. Матричный детектор SPAD состоит из 25 независимых диодов, расположенных в квадратной сетке. Небольшой размер и асинхронное считывание позволяют быстро обнаруживать падающие фотоны флуоресценции. Схема сбора данных, основанная на методе цифровой частотной области (DFD), представляет собой метод гетеродинной выборки, который позволяет строить гистограмму затухания флуоресценции с временным разрешением до 400 пс, что подходит для большинства приложений флуоресцентной визуализации.
Недавно разработанный компактный ISM-микроскоп, оснащенный матричным детектором однофотонных лавинных диодов (SPAD), обеспечивает структурные и функциональные изображения с высоким разрешением.
Фото: А. Зунино (ИТТ).
Мир лазерной сканирующей микроскопии быстро развивается благодаря появлению быстрых и компактных детекторных матриц. Эти матрицы заменяют типичный одноэлементный детектор традиционных конфокальных лазерных сканирующих микроскопов, открывая новые и уникальные возможности.
В то время как обычные детекторы предоставляют только значение интенсивности собранного света, пиксельный детектор также позволяет регистрировать пространственное распределение падающего света, эффективно создавая небольшое изображение освещенной области для каждой точки сканирования.
Дополнительная пространственная информация, предоставляемая матрицами детекторов, позволяет использовать метод сверхвысокого разрешения, известный как сканирующая микроскопия изображений (ISM). ISM вычислительно строит одно изображение из необработанного многомерного набора данных, полученного с помощью микроскопа. Окончательное изображение создается с лучшим соотношением сигнал/шум (SNR), оптическим срезом и пространственным разрешением, чем у традиционного конфокального микроскопа.
Подробно, латеральное разрешение изображения ISM может превосходить предел Аббе почти в два раза. Однако эти преимущества достигаются за счет использования только пространственной информации; Современная флуоресцентная биовизуализация может быть дополнительно усовершенствована за счет сбора данных с временным разрешением, что обеспечивает доступ к структурной и функциональной информации, закодированной в динамике флуоресценции (например, времени жизни флуоресценции).
Недавно исследователи из Итальянского технологического института (IIT) в Генуе разработали компактный и эффективный микроскоп ISM, оснащенный матричным детектором однофотонных лавинных диодов (SPAD), способным обеспечивать структурные и функциональные изображения с высоким разрешением в единой архитектуре. Исследование опубликовано в журнале Advanced Photonics.
Сообщаемый матричный детектор SPAD состоит из 25 независимых диодов, расположенных в квадратной сетке. Небольшой размер и асинхронное считывание позволяют быстро обнаруживать падающие фотоны флуоресценции. Схема сбора данных, основанная на методе цифровой частотной области (DFD), представляет собой метод гетеродинной выборки, который позволяет строить гистограмму затухания флуоресценции с временным разрешением до 400 пс, что подходит для большинства приложений флуоресцентной визуализации.
(а) Сравнение карт времени жизни конфокальной флуоресценции и ISM флуоресценции тубулиновых нитей клетки HeLa.
(b) Сравнение необработанных изображений тубулиновых нитей STED и ISM-SPLIT-STED.
(c) Векторное представление двух красителей с одинаковым временем жизни и перекрывающимися спектрами возбуждения, индивидуально возбуждаемых двумя разными лазерными импульсами (вверху). Векторное представление смешанного вклада двух красителей (внизу).
(d) Разделение каналов с использованием временного стробирования (слева) и векторного разделения (справа). Из-за перекрестных помех два красителя успешно различаются только при разделении векторов.
Фото: Тортароло, Зунино и др., doi 10.1117/1.AP.6.1.016003.
Этот метод достаточно прост, чтобы обеспечить вычисление гистограммы на той же плате программируемой вентильной матрицы (FPGA), которая используется для управления микроскопом и записи обнаруженного сигнала, что упрощает архитектуру микроскопа.
Благодаря уникальной пространственной и временной информации, предоставляемой матричным детектором SPAD, авторы продемонстрировали сочетание измерений времени жизни флуоресценции (FL) с ISM (FLISM). В дополнение к традиционным преимуществам ISM улучшенное соотношение сигнал/шум изображений FLISM позволяет более надежно оценить время жизни флуоресценции.
В отчете подчеркивается универсальность микроскопа за счет объединения измерений ISM и измерений с временным разрешением с микроскопией истощения стимулированного излучения (STED) с использованием метода разделения по времени жизни (SPLIT). Результатом является изображение с повышенным поперечным разрешением и контрастностью, полученное без изменения схемы получения. Кроме того, измерения с временным разрешением позволяют получать изображения нескольких видов с помощью одного детектора для повышения структурной специфичности.
Система может различать разные красители по значениям их времени жизни флуоресценции благодаря векторному представлению динамики флуоресценции . Даже используя красители с одинаковыми значениями времени жизни и перекрывающимися спектрами возбуждения, он может различать разные флуорофоры, используя метод импульсного чередования возбуждения.
Действительно, за счет чередования импульсов возбуждения лазера разных цветов спектральная информация эффективно кодируется во временном измерении. Благодаря превосходному временному разрешению предлагаемого микроскопа вклад двух флуоресцентных красителей позже можно разделить, чтобы избежать перекрестных помех.
По словам Джузеппе Висидомини, главного исследователя лаборатории молекулярной микроскопии и спектроскопии ИИТ и автора-корреспондента: «Результаты этой работы предполагают, что будущее лазерной сканирующей микроскопии тесно связано с детекторами-массивами SPAD, способными обогатить набор микроскопических данных дополнительными (пространственную и временную информацию) без необходимости изменения оптической архитектуры конфокального микроскопа».
Работа демонстрирует, что матричные детекторы SPAD в сочетании со специальной системой сбора данных делают ISM с фотонным разрешением легко доступным и пригодным для использования.
